2023-03-30
哈嘍,上期小編帶領(lǐng)大家簡單了解了下高效液相色譜和超高效液相色譜的差異,相信大家通過小編的介紹對兩者有了比較具體的了解。那么隨著小粒徑色譜柱的發(fā)展,越來越多的業(yè)內(nèi)人士期望使用亞2μm粒徑色譜柱的超高效液相色譜來拓寬選擇性、提高工作效率、降低耗能、減少污染。
今天小編就帶領(lǐng)大家看下如何將HPLC方法轉(zhuǎn)換為UHPLC方法。
1、保證轉(zhuǎn)換成功的前提 ● 相同的選擇性:選擇相同品牌,相同鍵合工藝制成的填料僅僅是粒徑不一致。 ● 相同或者更大的柱長粒徑比:這是保證具有相當(dāng)或者更高的理論塔板數(shù)。 2、方法如何轉(zhuǎn)換 ● 針對兩者差異進(jìn)行轉(zhuǎn)換研究:色譜柱填料粒徑不同,系統(tǒng)體積不同,儀器輸送流動(dòng)相系統(tǒng)內(nèi)徑不同,影響流速,進(jìn)樣量,梯度洗脫程序。 ● 需要調(diào)整參數(shù):流速,進(jìn)樣量,梯度洗脫程序。 1. 流速與柱半徑的平方成正比 例如: HPLC柱:4.6*150mm,5μm 流速:1.5mL/min UHPLC柱:2.1*100mm,1.8μm流速則為: 2. 樣品濃度不改變,進(jìn)樣體積與柱體積成正比 例如: HPLC柱:4.6*150mm,5μm 進(jìn)樣體積:20μL UHPLC柱:2.1*100mm,進(jìn)樣體積則為: 3. 梯度洗脫程序的轉(zhuǎn)換 等度方法只需要調(diào)整流速和進(jìn)樣量,如果是梯度洗脫則需調(diào)整梯度洗脫程序。調(diào)整的依據(jù),需計(jì)算在幾何縮放的流速下輸送相同倍數(shù)柱體積溶劑到目標(biāo)柱需要的時(shí)間。 同時(shí),由于不同儀器之間系統(tǒng)體積存在差異,也需要在轉(zhuǎn)換時(shí)加以考慮。梯度程序轉(zhuǎn)換的計(jì)算過程這里不做詳細(xì)描述。通常色譜儀器均配備轉(zhuǎn)換軟件,輸入原始洗脫程序,軟件可自動(dòng)計(jì)算并轉(zhuǎn)換為目標(biāo)儀器的洗脫,然后根據(jù)色譜峰分離情況進(jìn)行人工微調(diào)。 3、方法參數(shù)的優(yōu)化 1. 改善分離度:調(diào)整梯度洗脫程序,增加長度是便捷可行的措施; 2. 如果破壞試驗(yàn)檢測的雜質(zhì)情況不一致,轉(zhuǎn)換后的雜質(zhì)多且物料平衡優(yōu)于前者,兩者測定結(jié)果沒有明顯區(qū)別,轉(zhuǎn)換成功; 3. 如果結(jié)果明顯不一致,或涉及不合格情況,應(yīng)匯報(bào)相關(guān)負(fù)責(zé)人,是否需要對原方法進(jìn)行再評估或放棄方法轉(zhuǎn)換。 4、什么時(shí)候?yàn)檗D(zhuǎn)換失敗 1. 原則:系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)不符合要求; 2. 分離度調(diào)整后達(dá)不到要求; 3. 破壞性實(shí)驗(yàn)檢測出來物料平衡明顯不如HPLC法,方法優(yōu)化后不能解決; 4. 檢測結(jié)果與HPLC不一致,甚至出現(xiàn)不合格,那需要對原方法進(jìn)行評估或者放棄方法轉(zhuǎn)換。 5、UHPLC轉(zhuǎn)換方法需要驗(yàn)證的項(xiàng)目 1. 原則:系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)符合要求; 2. 峰純度達(dá)到要求; 3. 分離度達(dá)到要求; 4. 靈敏度達(dá)到要求; 5. 沒有系統(tǒng)適用性要求的項(xiàng)目進(jìn)行樣品2-3種條件的破壞性實(shí)驗(yàn),雜質(zhì)分離和物料平衡均要相當(dāng)。 在日常工作中,當(dāng)HPLC方法成功轉(zhuǎn)換為UHPLC方法后,不僅僅拓寬選擇性和提高工作效率,還降低耗能以及減少了污染。