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色譜柱固定相鍵合方式及修飾方法有哪些?

2023-02-09

日常工作中,經(jīng)常遇到老師咨詢硅膠單體表面的硅烷鍵合方式,是單鍵鍵合、雙鍵鍵合還是三鍵鍵和呢?填料表面是否有活性硅醇基,有沒有封端?碳鏈上是否嵌入極性官能團(tuán),是哪種官能團(tuán)?在有些項(xiàng)目標(biāo)準(zhǔn)上,要求固定相是堿基失活硅膠。熟悉固定相鍵合方式及其修飾,有助于了解色譜柱的使用條件,選擇合適的色譜柱。

制備反相色譜柱填料常用的方法是有機(jī)硅烷和硅膠表面的硅醇基上發(fā)生共價(jià)反應(yīng),來“鍵合”生成固定相或者配合基R:

X3-Si-R+≡Si-OH→≡Si-O-Si(X2)-R+HX

(硅烷)(硅烷醇)(更后的固定相)

HPLC柱子的制備可通過幾種不同的硅烷-硅膠反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)。單體相是反相柱子里使用廣泛的技術(shù),即一個(gè)硅烷分子和硅醇基反應(yīng)。這種一對(duì)一鍵合,使生成的鍵合相相對(duì)完善并且具有很好的重現(xiàn)性。這樣制作的填料通常會(huì)具有高的柱效,因?yàn)楣潭ㄏ鄬酉鄬?duì)不擁擠,因此溶質(zhì)分子能夠快速擴(kuò)散進(jìn)出固定相。相反,多官能團(tuán)的、高度聚合的固定相則表現(xiàn)出較低的溶質(zhì)擴(kuò)散速度和較低的柱效,尤其是在流動(dòng)相流速較高的情況下。

01 鍵合方式

目前單體的硅烷-硅膠鍵合技術(shù)主要分為四種:單鍵鍵合(Ultimate? XB-C18)、雙鍵鍵合(Sunfire C18)、三鍵鍵合(Ultimate? PAH)、雙齒鍵合(ZORBAX Extend C18)。單鍵鍵合有利于提高傳質(zhì)速率,加快色譜柱平衡,但在低pH條件下長期使用時(shí),單鍵鍵合相易流失,在色譜圖上表現(xiàn)為保留時(shí)間縮短。而使用多鍵鍵合的方式(雙鍵鍵合、三鍵鍵合和雙齒鍵合)可以提高固定相在低pH條件下的穩(wěn)定性。

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02 硅膠封端

因?yàn)榇嬖诮Y(jié)構(gòu)位阻,硅膠表面的硅醇基無法完全與硅烷分子鍵合,而殘留的硅醇基,可能與堿性化合物發(fā)生次級(jí)離子交換作用,導(dǎo)致峰形不佳,因此常采用體積較小的TMS(如三甲基硅烷)或者其他技術(shù)封端,使填料表面盡可能的減小殘留硅醇基。但是TMS在pH較低時(shí)容易被水解和破壞,這會(huì)造成保留時(shí)間和選擇性發(fā)生改變。另一方面來說,封端填料提高了色譜柱在堿性條件下的穩(wěn)定性,降低柱流失,并有利于色譜柱對(duì)極性和堿性化合物的分離、提供良好的峰形。

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03 空間位阻保護(hù)-側(cè)鏈烷基

在硅膠表面的十八烷基的側(cè)鏈上引入甲基、異丙基或異丁基,可以極大程度的屏蔽硅膠表面硅醇基的作用??臻g保護(hù)對(duì)于低pH的分離實(shí)驗(yàn)非常有幫助,避免了低pH條件下O-Si鍵的斷裂,但不能用在高pH條件下。具有空間保護(hù)功能的固定相可以以多種配合基的形式存在(比如,C8、C18、氰基、苯基),每個(gè)配合基在流動(dòng)相較低的pH條件下均能保持較高的穩(wěn)定性(pH低至0.8)。常見該類型色譜柱如月旭Ultimate? LP系列色譜柱。

04嵌入極性基團(tuán)

一般反相色譜柱對(duì)強(qiáng)極性和強(qiáng)堿性物質(zhì)分離較差,在反相固定相的碳鏈中嵌入極性基團(tuán)(如脲基、酰胺基、醚基或甲酸酯基),提高對(duì)此類物質(zhì)的選擇性,同時(shí)極性基團(tuán)屏蔽了硅膠表面的硅醇基作用,可極大改善峰形,在測定堿性物質(zhì)時(shí)不拖尾。典型代表如采用酰胺基團(tuán)的Ultimate? Polar-RP色譜柱。

另外碳鏈中存在極性基團(tuán),能使固定相的親水性濕潤性增強(qiáng),用到95%以上的高水流動(dòng)相時(shí),不會(huì)發(fā)生相塌陷。具有與普通的反相C18和C8柱不同的選擇性,特別是對(duì)于酚類等極性物質(zhì)。

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