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雜質(zhì)分離方法開發(fā)過程

2023-01-17

首先來看看需要分離的三個物質(zhì)的結(jié)構(gòu)式:

微信截圖_20230117141231.png

01 分析目的要求

開發(fā)一種合適的分析方法,使上述3種化合物在濃度1.0mg/mL的情況下分離度大于1.50。

開始方法開發(fā)之前,di一件該做的事是什么呢?

當(dāng)然是去了解這幾個物質(zhì)的性質(zhì),盡可能的得到有關(guān)這些物質(zhì)的信息,這樣可以為后面工作節(jié)省更多的時間。而對這三個物質(zhì)得到的信息大致如下:三種物質(zhì)極性比較強,水溶性比較好,在常規(guī)C18色譜柱保留太弱,基本上與溶劑峰重疊。結(jié)構(gòu)式上主要是官能團的差異,分別為-NH2,-Br,-COOH,差異性很大。

綜合考慮,有兩種方案:一是加離子對試劑,用反相C18色譜柱增強保留,進行分離;二是使用離子交換色譜柱進行分離。首先由于個人的習(xí)慣,離子交換色譜被我直接排除(離子色譜平衡比較慢,而且離子交換色譜柱非常容易出現(xiàn)重現(xiàn)性問題)。所以本實驗采用C18添加離子對試劑的方法。

考慮的實驗過程中需要使用離子對試劑,且流動相pH需要大范圍調(diào)整(可能用到堿性流動相),所以色譜柱選擇月旭XtimateC18(4.6×250mm,5μm)色譜柱,流速:1.0mL/min,柱溫30℃,檢測波長220nm。

02 流動相優(yōu)化及測試結(jié)果圖譜

2.1 初步嘗試流動相:0.05mol/L庚烷磺酸鈉+0.05mol/L磷酸二氫鉀,PH=4.60。

結(jié)果:化合物3保留時間2.6min,化合物1不出峰。估計是化合物1保留太強未洗脫下來。接下來,調(diào)整pH并增加有機相的比例,來加大洗脫能力。

2.2 流動相:緩沖液(1.00g辛烷磺酸鈉,10mM磷酸二氫鉀至500mL水中,用磷酸調(diào)pH=2.30):甲醇=60:40。

混合對照圖譜如下:

微信截圖_20230117141253.png

實驗中將庚烷磺酸鈉改為辛烷磺酸鈉,增加有機相(甲醇)比例,結(jié)果三個物質(zhì)分離良好,但是化合物1(19.9分鐘)峰型太差,下一步優(yōu)化化合物1的峰型。

2.3 流動相:緩沖液(1.00g辛烷磺酸鈉,10mM磷酸二氫鉀至500mL水中,用磷酸調(diào)pH=2.30):乙腈=80:20。

化合物1圖譜:

微信截圖_20230117141300.png

基于上一次實驗,將有機相甲醇變?yōu)橐译妫ㄟ^改變選擇性看是否峰型會有改善。結(jié)果發(fā)現(xiàn)并沒有任何改善,而且發(fā)現(xiàn)這個方法中有機相只提供洗脫能力,不提供選擇性改變作用。

2.4 流動相:緩沖液(緩沖液:1.00g十二烷基磺酸鈉,50mM氯化銨至500mL水,用磷酸調(diào)pH=1.80):甲醇=60:40。

混合對照圖譜:

微信截圖_20230117141307.png

當(dāng)時換成這個流動相的主要思路是,加十二烷基磺酸鈉使保留更強,加氯化銨提高離子濃度,調(diào)pH至1.80強酸性使化合物1中-NH2官能團作用更弱,達到優(yōu)化峰型的目的,但是效果很差?;仡^總結(jié)發(fā)現(xiàn)我們所有的目光都聚焦在三種物質(zhì)的不同官能團上,導(dǎo)致越走越偏離分離的軌跡,這里,三個物質(zhì)共同含有的官能團可能也是影響分離的主要因素,換了個角度后,豁然開朗了。推翻了之前的方案,將離子對試劑換為四丁基氫氧化銨,從頭開始。

2.5 流動相:緩沖液(4mL 10%四丁基氫氧化銨水溶液,1.36g磷酸二氫鉀至500mL水中,用三乙胺調(diào)pH=9.30):乙腈=80:20。

混合對照圖譜:

微信截圖_20230117141312.png

流動相中添加三乙胺和并將pH調(diào)成9.3目的是抑制化合物1的拖尾,但是結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種物質(zhì)沒有分開。繼續(xù)優(yōu)化條件將pH值降低。

2.6 流動相:緩沖液(4mL 10%四丁基氫氧化銨水溶液,1.36g磷酸二氫鉀至500mL水中,用三乙胺調(diào)pH=7.00):乙腈=80:20。

混合對照圖譜:

微信截圖_20230117141318.png

看到這結(jié)果是不是項目就OK了。但是既然是方法開發(fā),方法重現(xiàn)性實驗實驗是必不可少的,需要用一根新色譜柱重現(xiàn)該色譜條件。

結(jié)果問題就來了.....

化合物1圖譜:

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化合物1峰型一直分叉,更終發(fā)現(xiàn)應(yīng)該是色譜柱使用多種離子對試劑,造成色譜柱改性,新色譜柱不能重現(xiàn)結(jié)果。好吧,再開始。

然后又是繼續(xù)摸索。不得不說有時候運氣也是成功的一部分,在一次流動相配置過程中,看到四丁基氫氧化銨試劑旁邊還有一瓶四丁基溴化銨,突然我就冒出想法,用四丁基溴化銨試試,不知道結(jié)果會怎么樣,說做就做。

2.7 流動相:緩沖液(1.00g四丁基溴化銨,1.36g磷酸二氫鉀,1.0mL三乙胺至500mL高純水。用磷酸調(diào)節(jié)pH=7.10):乙腈=80:20。

混合對照圖譜:

微信截圖_20230117141330.png

03 結(jié)果

結(jié)果:分離度,峰型都滿足要求,完美。當(dāng)然還是需要重現(xiàn)方法的。

三根新色譜柱重現(xiàn)結(jié)果:

微信截圖_20230117141338.png

更終色譜條件:

色譜柱:月旭XtimateC18(4.6*250mm,5μm)。

流動相:緩沖液(1.00g四丁基溴化銨,1.36g磷酸二氫鉀,1.0mL三乙胺至500mL高純水。用磷酸調(diào)節(jié)pH=7.10):乙腈=80:20

檢測波長:220nm;

柱溫:30℃;

流速:1mL/min;

進樣體積:10μL。

搞定交差!

微信截圖_20230117141347.png

04 實驗小結(jié)

在液相應(yīng)用方法開發(fā)過程中,首先需結(jié)合需要分離的目的,確定思路,一個方法更初的思路,是決定這個方法開發(fā)的效果,效率的更根本因素;其次是細(xì)節(jié),任何細(xì)節(jié)都有可能導(dǎo)致你實驗的成功與否;更后是運氣,牛頓發(fā)現(xiàn)萬有引力還有運氣成分呢,說不定你是下一個。

同時,在一個方法確定好之后,一定需要使用一根新的色譜柱來驗證,因為在方法開發(fā)過程中,我們會使用到各種流動相條件,會對色譜柱一個改性,特別是使用離子對試劑的方法,否則后續(xù)的重現(xiàn)性問題會是一個非常頭痛的事情。

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