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梯度洗脫在反相色譜中的作用(上篇)

2023-01-10

梯度洗脫可用于處理不能以等度洗脫分離的樣品,而更常見的使用梯度的因素是多成分保留能力不同,無(wú)法在等度洗脫中全洗脫出來(lái),或以等度方式無(wú)法達(dá)到滿意的分離效果??偨Y(jié)下來(lái),以下幾種情況,可以采用梯度洗脫:

1、多組分樣品的極性范圍大,用等度無(wú)法全部洗脫的樣品;

2、大分子樣品;

3、改善峰峰型;

4、目標(biāo)峰出峰后,短時(shí)間內(nèi)提高有機(jī)相比例,洗脫強(qiáng)保留干擾雜質(zhì);

5、用等度洗脫無(wú)法達(dá)到分離的情況。

#01、多組分樣品的極性范圍大,

用等度無(wú)法全部洗脫

具有不同保留值范圍的多組分,無(wú)法使用同一個(gè)等度完全洗脫下來(lái)。用同一個(gè)等度,會(huì)出現(xiàn)要么部分成分無(wú)保留沒(méi)法分離,部分強(qiáng)保留無(wú)法洗脫下來(lái),或一針洗脫時(shí)間過(guò)久的問(wèn)題,這種情況下,選擇梯度洗脫,使流動(dòng)相洗脫能力從弱到強(qiáng),從而達(dá)到不同保留值范圍的多組分在同一個(gè)條件下實(shí)現(xiàn)分離。

#02、大分子樣品

大分子量樣品(肽、蛋白質(zhì)、合成聚合物等)一般采用梯度洗脫分離會(huì)更好,尤其是反相條件。這類樣品,往往對(duì)有機(jī)相的量特別敏感,有機(jī)相的微小變化就會(huì)使樣品的保留時(shí)間發(fā)生很大的變化,導(dǎo)致用等度條件檢測(cè)時(shí),無(wú)法使保留時(shí)間控制在一個(gè)穩(wěn)定合適的范圍內(nèi)。

#03、改善峰型

有些成分,在使用等度洗脫時(shí),峰型不佳,不能滿足檢測(cè)需求,這種時(shí)候,可以采用梯度洗脫來(lái)改善峰型。因此,哪怕是單一成分的含量測(cè)定,有時(shí)也會(huì)用到梯度洗脫進(jìn)行測(cè)定。

示例:4-哌啶甲酸的檢測(cè)

微信截圖_20230110145905.png

由對(duì)比圖可以發(fā)現(xiàn),4-哌啶甲酸成分,在使用等度洗脫時(shí),不對(duì)稱度3.8,拖尾明顯,采用梯度洗脫后,不對(duì)稱度為1.78,拖尾現(xiàn)象改善明顯。

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