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使用NTAIDA填料純化蛋白的常見(jiàn)問(wèn)題解析

2021-05-11

Ni Tanrose 6FF(NTA)親和介質(zhì)是將金屬離子Ni2+螯合在以氨三乙酸(NTA)為配基的瓊脂糖凝膠上形成的親和層析介質(zhì),較 IDA 結(jié)合Ni2+牢固一些。具有吸附量大、選擇好、易于再生、成本低等特點(diǎn),廣泛用于生物制藥和生物工程下游蛋白質(zhì)和多肽的分離純化,尤其是組氨酸標(biāo)簽蛋白質(zhì)的高效純化。

Ni Tanrose 6FF(IDA)親和介質(zhì)是將金屬離子Ni2+螯合在以亞氨基二乙酸(IDA)為配基的瓊脂糖凝膠上形成的親和層析介質(zhì),是一種非常悠久的Ni2+親和填料,由于Ni2+與配基鰲合鍵較少,容易受到小分子的攻擊而使Ni2+容易脫落,但其載量也相對(duì)較高。

以下是使用NTA/IDA填料可能會(huì)出現(xiàn)的問(wèn)題及解決方法:

01 通過(guò)His標(biāo)簽純化的蛋白,雜質(zhì)比較多應(yīng)當(dāng)怎么做?

①可能原因:蛋白酶會(huì)降解部分目的蛋白。

解決方法:加入多種蛋白酶抑制劑改進(jìn)。

②可能原因:雜質(zhì)蛋白與鎳柱親和力強(qiáng)。

解決方法:可提高雜質(zhì)蛋白與鎳柱結(jié)合起始咪唑濃度。

③可能原因:雜蛋白和目的蛋白結(jié)合。

解決方法:可通過(guò)超聲前加入去垢劑或者還原劑消除(1%-2% Triton X-100)。

④可能原因:洗滌不充分。

解決方法:增加洗滌的次數(shù),充分洗滌。

02 標(biāo)簽蛋白不與金屬螯合親和層析柱結(jié)合應(yīng)當(dāng)怎么做?

①可能原因:超聲的功率不對(duì)(功率太大會(huì)導(dǎo)致蛋白炭化,功率太小會(huì)導(dǎo)致蛋白沒(méi)有釋放)。

解決方法:改變超聲功率或超聲前嘗試添加溶菌酶增加細(xì)胞破碎率。

②可能原因:組氨酸標(biāo)簽暴露不完Q。

解決方法:在變性條件下(4-8M脲或4-6M鹽酸胍)進(jìn)行純化,此時(shí)Ni-6FF(IDA)中鎳離子容易脫落,可選擇耐受變性劑的螯合填料,如月旭科技的親和填料Ni Tanrose 6FF(NTA)。

③可能原因:His標(biāo)簽丟失。

解決方法:WB檢查His-tag是否表達(dá),上游構(gòu)建,改變His-tag的位置(C-端或N-端),必要時(shí)增加標(biāo)簽個(gè)數(shù);孵育的時(shí)間不夠,降低流速和增加孵育的時(shí)間。

03 用幾次后鎳柱載量下降、掛柱效率低,應(yīng)該怎么做?

可能原因:

逐漸積累沉淀,變性或非特異結(jié)合的蛋白占據(jù)了有效的結(jié)合位點(diǎn),并且通過(guò)洗脫液無(wú)法徹底清洗所致。

解決方法:

較溫和的清洗方式:用2倍柱體積的6M鹽酸胍或8M尿素洗滌,然后用5倍體積的緩沖液洗滌,以去除沉淀或變性物質(zhì),接著用2倍柱體積的1% Triton X-100洗滌,然后用5倍柱體積的緩沖液洗滌,以去除疏水結(jié)合的物質(zhì)。若改變不明顯,可選擇強(qiáng)烈清洗方式。

強(qiáng)烈清洗方式:首先用5-10倍柱體積的脫鎳緩沖液(20 mM 磷酸鈉,0.5 M NaCl,,50 mM EDTA,pH 7.4)洗滌,進(jìn)行脫鎳操作,然后用5-10倍柱體積的平衡緩沖液沖洗,更后用5-10倍柱體積的雙蒸水沖洗;隨后進(jìn)行清洗操作,去除離子型雜蛋白,可以用5倍柱體積的1.5M NaCl溶液,然后10倍柱體積的雙蒸水沖洗;去除沉淀或變性蛋白,可以用1M氫氧化鈉溶液,結(jié)合1-2小時(shí),然后用10倍柱體積的平衡緩沖液和10倍柱體積的雙蒸水迚行沖洗;去除疏水蛋白或者脂蛋白,可以用5-10倍柱體積的30%異丙醇溶液清洗,然后10倍柱體積的雙蒸水洗滌;更后進(jìn)行生鎳操作,用0.1M硫酸鎳上柱,隨后5倍柱體積的雙蒸水和平衡緩沖液迚行洗滌。如需保存,保存在20%乙醇溶液。

04 簽蛋白結(jié)合在填料上洗脫不下來(lái),應(yīng)該怎么做? 

①可能原因:洗脫條件太溫和(標(biāo)簽蛋白仍然結(jié)合在柱上,結(jié)合力較強(qiáng))。

解決方法:增加咪唑的梯度洗脫或降低pH 來(lái)找出更佳的洗脫條件。

②可能原因:降低pH的方法洗脫,若pH低于3.5,會(huì)導(dǎo)致鎳離子脫落。

解決方法:改變洗脫辦法,如咪唑競(jìng)爭(zhēng)性洗脫。

③可能原因:蛋白已沉淀在柱上。

解決方法:1.減少上樣量,或使用咪唑的線(xiàn)性梯度而不是分步洗脫以降低蛋白的濃度。試用去污劑或改變NaCl的濃度,或在變性條件(去折疊)下洗脫(用4-8 M脲,或4-6 M鹽酸胍);2.蛋白在柱上變性固化,用0.5M氫氧化鈉洗柱。

④可能原因:非特異性疏水或其他相互作用。

解決方法:加非離子去污劑到洗脫緩沖液(如:2% Triton X-100)或增加NaCl的濃度。

⑤可能原因:在填料表面形成高密度融合蛋白的聚集。

解決方法:選擇合適載量的填料,切勿一味追求高載量。

05 柱使用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)堵塞嚴(yán)重,且流速越來(lái)越慢應(yīng)該怎么做?

可能原因:

樣品中細(xì)胞碎片或其他雜顆粒所致。

解決方法:

樣品處理過(guò)程中,高速離心,推薦用0.45um的濾膜過(guò)濾。如果柱子堵塞嚴(yán)重,重生時(shí)使用1% Triton X-100/PBS浸泡過(guò)夜。流速慢,可在柱子下面接一根軟管。

06 鎳柱使用過(guò)程中出現(xiàn)棕色應(yīng)該怎么做?

可能原因:

緩沖液中DTT的影響,DTT會(huì)對(duì)鎳柱的顏色和純化效率有很大的影響,在堿性的緩沖液條件下,鎳離子會(huì)被DTT還原生成棕色的沉淀,所以要盡量避免DTT的參與。

解決方法:

若樣品中含有DTT,在上樣之前, 我們推薦采用不含還原性試劑的空白運(yùn)行來(lái)除去任何較弱結(jié)合的鎳離子。

空白運(yùn)行方法(使用不含還原劑的平衡液和洗脫液):

1)5倍柱體積的雙蒸水洗柱;

2)5倍柱體積的平衡液洗柱;

3)5倍柱體積的洗脫液洗柱;

4)10倍柱體積的平衡液平衡。

當(dāng)不使用時(shí),勿將Ni Tanrose 6FF(IDA)保存于含還原性試劑的緩沖液中。

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